隨著“后基因組時代”的到來,蛋白質及其復合物的結構和功能研究已成為目前生命科學領域的前沿,在蛋白質科學研究中意義重大。獲取蛋白質分子結構信息的主要手段是X射線衍射技術,然而蛋白質結晶一直是該技術的瓶頸問題。因此,蛋白質結晶是蛋白質結構與功能研究中的關鍵環節之一,開展蛋白質結晶研究對于制備高質量蛋白質晶體,進而保證高精細結構信息的獲取,具有十分重大的意義。

蛋白質晶體在物化性質上有很多的特殊性。首先,它們尺寸較大、密度較低、極度柔軟、雜質水平較高;其次,對過飽和度、溫度、pH值、析出劑濃度、壓力等環境因素十分敏感;再次,蛋白質晶體需要維持完全水合狀態,因此,晶體只能在其母液中研究。這些是一些高分辨率觀察研究手段如電子顯微鏡難以克服的障礙。

而20世紀80年代誕生的原子力顯微鏡技術,則完全可以解決上述問題,因此成為可以在納米到微米尺度范圍內直接觀察蛋白質晶體的有力手段。更為重要的是,在原子力顯微鏡掃描過程中,針尖的移動對被研究樣品影響甚微,因此它是一種近似的非侵入式研究手段。由于該特點,它除了觀察形貌外,還可以研究各種正在發生的動態過程,通過研究這些動態過程中的變化,并與相關的動力學條件聯系,即可研究動力學過程的機理。這種能力為研究蛋白質晶體生長動力學過程提供了前所未有的理想條件。利用該技術,甚至可以觀察到蛋白質分子如何進入到晶體狀態的過程。可見,它對于了解和研究蛋白質晶體生長過程具有重要意義。20世紀90年代初Durbin等首次將原子力顯微鏡應用到蛋白質晶體生長研究,此后,人們在這個領域開展了大量的研究工作。通過原子力顯微鏡,不僅實現了蛋白質晶體從單個分子到小晶體尺度范圍內的可視化,還觀察到了蛋白質晶體生長的各種生長機制,并研究了晶體生長的動力學過程,揭示了蛋白質晶體生長與小分子晶體生長的相同之處,同時也發現了一些與小分子晶體生長不同之處。此外,還開展了對蛋白質晶體缺陷的研究。由于蛋白質晶體的缺陷是導致X射線衍射分辨率低下的關鍵因素,因此該工作具有十分重要的意義。本文對近年來原子力顯微鏡研究蛋白質晶體生長的進展進行評述,并對其未來將在蛋白質晶體學領域發揮更加重要作用做了預期。

研究形核的目的,一是讓不易結晶的生物大分子形核;二是盡量減少易結晶的生物大分子形核的數量。這不僅可以滿足X射線衍射的要求,而且有重要的實際意義,例如等尺寸形核的晶體作為藥物時,可穩定等速度釋放藥效。形核過程作為蛋白質結晶的第一個過程,由于其自發性和在時間和空間上的不可預見性,所以迄今為止研究還相對較少。

蛋白質晶體生長的母液復雜而且易變,其中除了大多數小而穩定的聚集物,還有較大的亞穩液相聚集物。而后者有快速形成多層聚集物或微晶的潛能,而且會對生長晶體長序結構有所貢獻。利用原子力顯微鏡AFM,在晶體表面已觀察到上述亞穩液相聚集物的存在。實驗過程中先在襯底附著少量的含有蛋白質晶體的溶液,然后放入AFM液體池內,加入大量的蛋白質過飽和溶液。在最初階段,AFM觀察到了晶體表面聚集體的沉降。Kuznetsov等認為沉降前的液相聚集物可能有兩種趨勢,一是形成規則的晶體,其發展取決于底層晶胞。二是形成不同于底層晶胞的微晶,并最終與底層晶體合并。從晶體分離的部分蛋白質分子可能沒有溶解到溶液中,而是形成了可在晶體表面結晶的亞穩態液相聚集物。

盡管蛋白質晶體在溶液中的形核是不可預見的,然而在襯底上的異質形核還是有一定的可控性。Rong等利用原子力顯微鏡在涂有聚賴氨酸的玻璃底層上成功控制了溶菌酶晶體的形核方向。Kubo等利用AFM發現了溶菌酶晶體低溫相(110)面傾向平行于厚的脂肪酸薄膜和空白的云母片底層,并發現其取向形核程度不但隨醋酸鈉濃度的增加而增加,而且顯著地受pH值和過飽和度的影響。